白菜型油菜srb多室性状的遗传分析与分子鉴定（一） PCR扩增程序为94℃预变性4min

油菜是白菜我国重要的油料作物,其角果一般由两心皮的雌蕊发育而来,角果内被假隔膜分为两室,种子着生于其中,外被两片壳状果瓣。在自然界中也发现了多室油菜突变体,型油性状析分其角果由多心皮雌蕊发育而成,角果内被假隔膜分为3～5室,外被3～5片壳状果瓣。这种自发突变体资源十分稀少,菜s传分其中白菜型油菜(Brassicarapa,AA,2n=20)中主要有印度的黄籽沙逊多室油菜和中国西藏的桑日白油菜等2种多室材料；在芥菜型油菜(B.juncea,AABB,2n=36)中有山西的三筒油菜、贵州的多室的遗四轮油菜、青海的鉴定多室油菜和四川的四棱油菜等多室油菜。已有研究表明,白菜多室油菜相对于两室油菜主要具有两大优良特性:(1)多室油菜具有较多的每角果粒数,可显著提高单株产量,在油菜的高产育种中具有应用潜力；(2)多室角果的抗裂角性较强,可用于抗裂角的研究和育种。因此,型油性状析分多室油菜作为一种新的种质资源,阐明其形成的遗传和分子机理,不仅可以丰富油菜花器官形态建成的理论,也有助于油菜高产新品种的培育。

遗传研究表明,菜s传分白菜型油菜中的多室/两室相对性状受1对主效核基因的控制,两室性状对多室性状表现为完全显性,且无细胞质效应的影响。通过图位克隆的多室的遗方法,Fan等发现,拟南芥CLV3(CLAVATA3)的同源基因调控黄籽沙逊ml4多室角果的形成；转基因互补测验和体外多肽的处理试验证明,该基因的1个单核苷酸突变(C/T)导致其CLEmotif中第9位的脯氨酸突变成亮氨酸,引起CLV3多肽活性的丧失,最终导致了油菜多室角果的产生。在芥菜型油菜中,鉴定多室性状受1个隐性核基因或2个独立遗传的隐性核基因控制,同样两室对多室表现为完全显性,且无细胞质效应的影响。通过基因的白菜精细定位,Xiao等和Xu等分别将拟南芥CLV3多肽信号的受体CLV1(CLAVATA1)的同源基因作为芥菜型油菜A7染色体上的多室候选基因。Xiao等进一步证实,型油性状析分BjuA07.CLV1基因编码区和启动子上的序列变异导致了芥菜型油菜多室的产生。在模式植物拟南芥中,菜s传分CLV信号途径调控了茎顶端分生组织内干细胞的分裂与分化之间动态平衡；当CLV3多肽信号或其受体发生突变时,CLV信号的传递就会受到影响,从而导致顶端分生组织的干细胞数目增加、多心皮雌蕊和多室角果的多室的遗产生。鉴于CLV信号途径在植物多室性状形成中的鉴定重要作用,Yang等利用基因编辑技术对甘蓝型油菜中的CLV3、CLV1和CLV2等同源基因进行了突变,创建了具有稳定多室性状的突变体资源。由此表明,CLV信号途径在不同类型油菜的多室角果形成过程中具有功能保守性。

来自西藏的桑日白油菜(简称srb)是目前在我国发现的仅有的白菜型多室突变材料,与黄籽沙逊多室油菜具有完全不同的来源；该突变体的多室性状表现稳定,且受1对隐性基因控制。但至今仍然没有该材料中的多室基因精细定位和克隆的相关研究报道。因此,本研究对srb突变体的遗传进行了分析,并通过与ml4突变体的等位测验以及候选基因的验证,发现了该材料中存在的一种新的BrCLV3基因等位突变导致了多室角果的产生。该研究为进一步深入解析BrCLV3基因参与油菜多室性状形成的分子机制提供了重要的材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料及其种植

所用的白菜型油菜包括两室黄籽沙逊(野生型,简称WT)、多室黄籽沙逊ml4以及来自西藏的多室srb。将srb分别与WT和ml4进行正反交得到F₁,然后自交产生F₂分离群体,用于srb多室性状的遗传分析。所有材料于2017年9月在华中农业大学油菜玻璃温室进行盆栽种植,花盆直径25cm,每盆定苗4株,参照正常方法管理温室,翌年1月至2月份调查花器官数目和角果心皮数目变异。拟南芥突变体clv3-2和野生型Landsbergerecta(ler)购自美国ArabidopsisBiologicalResourceCenter(ABRC)。在昼/夜16h/8h、22℃/18℃、光照强度115～144μmolm^-2s^-1的培养室内生长。

1.2 BrCLV3等位基因的比较测序

在白菜型油菜中仅存在1个CLV3的同源拷贝,即位于A4染色体上的BrCLV3(Bra034340)。针对该基因的不同区域共设计了3对PCR引物进行扩增,其中DXP118/DXP120扩增2260bp的启动子区域,DXP117/DXP121扩增基因编码区,DXP125/DXP136扩增2541bp的3'下游区。具体引物序列见表1。扩增产物连入pMD18-T载体上,每个扩增片段挑选4～5个阳性克隆采用载体通用引物测序；使用Sequencher3.1.2软件比对分析测序结果。

1.3 SNP分子标记开发与基因型分析

利用SNAPER程序,针对Brclv3Asp12中的C/G单核苷酸变异开发特异性的SNP标记,其中引物对DXP246/249和DXP248/DXP249分别特异性扩增Brclv3Asp12和BrCLV3等位基因。扩增产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。引物序列见表1。SNP标记的PCR扩增体系含50ngµL-1的模板DNA2.0µL、10×PCRbuffer1.0µL、2mmolL^-1dNTPs0.8µL、10µmolL^-1引物各0.15µL、2UµL^-1TaqDNA聚合酶0.15µL,添加ddH2O至10μL。PCR扩增程序为94℃预变性4min；94℃变性30s,59℃退火30s,72℃延伸30s,扩增34个循环；最后72℃延伸10min。

1.4 Brclv3Asp12的超量表达载体构建与遗传转化

设计分别带有PacI和AscI酶切接头的引物对DXP113/DXP114,从srb突变体的cDNA中克隆Brclv3_Asp12等位基因,通过酶切连接方法连入pMDC83质粒载体的35S启动子后面,获得35S::Brclv3_ASP12超量表达载体。引物序列见表1。载体质粒转化农杆菌菌株GV3101后通过蘸花法转化拟南芥clv3-2突变体。收获的种子播种到含有潮霉素抗性的0.5×MS培养基上筛选转基因阳性植株。

1.5 石蜡切片的制作与显微观察

选取花蕾进行石蜡切片的制作,具体操作程序见Fan等的方法。采用Nikoneclipse80i显微镜(日本)观察切片并照相。

1.6 多肽的合成与体外处理

分别合成野生型多肽BrCLV3(RTVPSGPDPLHH)和突变型多肽Brclv3ASP12(RTVPSGPDPLHD),纯度＞95%(金斯瑞,中国南京)。用超纯水溶解成1mmolL^-1母液后过滤消毒,保存于−20℃冰箱中备用。将表面消毒的拟南芥种子在添加多肽的液体和固体培养基上培养,分别观察多肽对茎顶端分生组织(shootapicalmeristem,SAM)和主根生长的影响。具体操作程序见Fan等的方法。每种处理至少设置3次生物学重复。

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